摘要
下丘脑弓状核（ARC）的β-内啡肽神经传递的戒断相关损害与酒精依赖有关，其特征是慢性复发。尽管针刺激活了投射到伏隔核(NAc)的弓状核β-内啡肽神经元，但尚未观察到ARC中β-内啡肽神经元在酒精依赖和针刺效应中的作用。在这里，我们表明针刺神门(HT7)穴通过激活ARC向NAc的内啡肽能传入来减弱酒精依赖的行为表现。针刺减轻了乙醇依赖大鼠的酒精戒断震颤、焦虑样行为和乙醇自身给药，这些效应可以通过向NAc局部注射β-内啡肽来模拟。针灸还逆转了酒精戒断过程中NAc中β-内啡肽水平的降低和ARC中神经元活动的减少。这些结果表明，针灸可能通过直接激活大脑通路为酒精使用障碍提供一种新的、潜在的治疗策略。
前言：
酒精使用障碍(AUD)的特点是戒酒一段时间后慢性复发，这仍然是世界上重大的公共卫生问题之一。成功治疗AUD最重要的方法是降低饮酒需求和复用率。不幸的是，没有令人满意的医学干预措施来防止酒精复用。酒精依赖大鼠中低水平的阿黑皮素原信使RNA表明长期饮酒会导致下丘脑内侧基底部β-内啡肽能神经元活性降低。下丘脑中β-内啡肽能神经元活性降低可能是与酒精戒断相关的烦躁和抑郁状态的原因，并可能导致酒精的持续使用。此外，有人提出NAc中的β-内啡肽可以调节应对压力的反应，这有助于酒精依赖的缓解。慢性酒精依赖的戒断会导致NAc中细胞外多巴胺(DA)水平的降低，这被认为是与酒精戒断相关的负面状态和身体戒断症状的关键潜在原因之一，并引发酒精的复用。有相当多的证据支持NAc中内源性阿片系统和多巴胺能神经传递之间的相互作用。因此，β-内啡肽可能在减轻酒精依赖方面发挥重要作用。
针刺刺激下丘脑ARC中的β-内啡肽能和脑啡肽能神经纤维，而起源于ARC的内啡肽能神经元可以依次激活表达在NAc-结构中的γ-氨基丁酸(GABA)神经元上的阿片受体，这些结构会参与乙醇强化。已有证据证明内源性阿片系统与针灸抑制滥用药物强化效应有关。相关研究表明非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮可抑制酒精依赖大鼠的酒精摄取。我们之前的研究表明，针刺位于腕部尺侧的神门穴可能通过激活内啡肽传入NAc，在调节中脑缘的DA释放以及酒精自我给药方面发挥重要作用，并且通过恢复NAc中DA水平以减少戒断症状。由于β-内啡肽可以增强NAc中DA的释放，我们假设针刺可能刺激下丘脑内啡肽能纤维，恢复酒精戒断期间NAc中β-内啡肽的水平，从而通过恢复NAc中的DA水平来防止戒断症状引发的症状及负面情绪状态。为了验证这一假设，我们评估了(i)针刺对酒精依赖大鼠酒精戒断的生理和心理症状的影响，(ii)NAc中内源性阿片系统在针刺和酒精戒断效应中的作用。
针刺对酒精戒断后震颤症状的影响
慢性酒精饮食(酒精组)的大鼠接受含酒精的饮食，其配对喂养的大鼠(对照组)接受右旋糖酐替代酒精的等卡路里饮食。大鼠在停止慢性酒精摄入后2小时接受针灸治疗。针灸后评估震颤情况。A：第0小时和2小时的代表性力信号(滤波器，10至22Hz)，对照组(n=5)或酒精组(n=5)。B：不同时间点相较于基线的震颤活动强度。C：机械针灸仪(MAI)。D：针刺对酒精戒断后震颤的影响。在停止长期酒精饮食后2小时给予酒精组大鼠针刺治疗并测量震颤活动。另一组对照饮食大鼠(CON-对照组)和酒精饮食大鼠(CON-酒精组)不接受任何针刺。CON-对照，n=8；HT7-对照，n=7；CON-酒精，n=7；HT7-酒精，n=7；LI5-酒精，n=6。图表示平均值±SEM。#P0.05与Con-对照组，*P0.05与Con-酒精组。
伏隔核中β-内啡肽参与针刺抑制酒精戒断震颤。
纳洛酮对针刺HT7抑制酒精戒断后震颤的影响。A：酒精组代表性力信号的示例(滤波器：10至22Hz)B：酒精组和对照组15分钟内震颤活动，用平均值表示。酒精依赖大鼠在腹腔注射纳洛酮后30分钟接受针刺并检测震颤活动。#P0.05vs生理盐水对照组(n=8)，*P0.05vs生理盐水-酒精组(n=7)，$P0.05生理盐水+HT7-酒精组(n=7)；纳洛酮+HT7-酒精组，n=7；纳洛酮-酒精，n=9。CD：针刺HT7对伏隔核内β-内啡肽含量的影响。酒精组大鼠的β-内啡肽基础值相比于其他组显著降低。（###P0.与其他组比,n=6）大鼠停止慢性酒精饮食2小时后接受针刺并检测伏隔核中β-内啡肽的水平。（***p＜0.与其他组比，n=6每组）E：伏隔核内注射β-内啡肽对酒精戒断后震颤的影响。大鼠停止慢性酒精饮食2小时后接受伏隔核内注射β-内啡肽并检测震颤。###p＜0.与生理盐水-对照组比，**p＜0.01，***p＜0.与生理盐水-酒精组比，生理盐水-对照组，n=6;生理盐水-酒精组，n=7；β-内啡肽（0.25）-酒精组，n=6；β-内啡肽-酒精组，n=5。
针刺对下丘脑弓状核神经元活动的影响
A和B：a对照组大鼠弓状核中c-Fos免疫组化染色。b和c大鼠接受HT7和LI5针刺。与对照组或LI5针刺组大鼠相比，HT7针刺组大鼠弓状核中c-Fos阳性细胞显著上升针刺组大鼠弓状核中标记有Dil（e）的c-Fos阳性细胞（d）（f）。比例尺，50um(×)C：对照组（n=7）和酒精饮食组（n=7）大鼠在针刺前和针刺过程中，弓状核神经元自发和激发电活动的典型波形。D：对照组和酒精饮食组大鼠在针刺前的基础激发率。**p＜0.01和对照组比。E：针刺对对照组和酒精饮食组大鼠基础激发率的影响。通过图形记录分析静息20s和针刺治疗10s的单细胞活性。*P0.05与对照组相比。
针刺或NAc内注射β-内啡肽对酒精依赖大鼠高架十字迷宫中焦虑样行为的影响。
A：yohimbine对进入开放臂时间的影响。在注射yohimbine(5mg/kg，腹腔注射)后30分钟测量未使用酒精大鼠进入开放臂时间百分比(#P0.01与生理盐水组，每组n=5)。B：针灸对进入开放臂时间的影响。在停止长期酒精饮食后2小时给予针灸的大鼠测量在开放臂中花费的时间的百分比。与对照组(n=9)或HT7-对照组(n=9)相比，P0.，*与Con-酒精组(n=9)；HT7-乙醇组(n=8)相比，P0.。C:NAc内注射β-内啡肽对开放臂时间的影响。在停止长期酒精饮食后2小时内给予β-内啡肽的大鼠测量在开放臂中花费的时间的百分比。#P0.05-对照组，*P0.05，与Con-酒精组比较，n=6每组。
针刺或NAc内注射β-内啡肽对酒精依赖大鼠自我给药的影响
A：实验流程。BC：针刺对酒精依赖大鼠自我给药的影响。在停止长期酒精饮食后2小时给予针刺的大鼠中检测自我给药情况。#P0.05与Con-对照组；*P0.05与Con-酒精组，n=6每组。DE：NAc内注射β-内啡肽对酒精依赖大鼠自我给药的影响。在停止长期酒精饮食后2小时内给予NAc内注射β-内啡肽的大鼠检测自我给药情况。#P0.05与CON对照组；*P0.05与CON-酒精组；CON-对照组，n=6；CON-酒精组，n=8；β-内啡肽-酒精组，n=7。
NAc内注入β-内啡肽对腹侧被盖区中酪氨酸羟化酶（TH）表达和磷酸化的影响。AB：酒精戒断后2小时给予NAc内注入β-内啡肽的酒精组腹侧被盖区神经元TH免疫组织化学染色(c)。另一组为对照饮食大鼠(a)(CON对照组，n=7)和酒精饮食大鼠(b)(CON-酒精组，n=7)，用人工脑脊液灌注代替β-内啡肽灌注。与对照组大鼠相比，大鼠(β-内啡肽-乙醇组，n=6)内注入β-内啡肽的大鼠腹侧被盖区内TH阳性细胞数显著增加[#P0.05，对照对酒精；*P0.05，Con-酒精与β-内啡肽-酒精；(B)]。比例尺，50um(x)。CD：酒精戒断后2h给予β-内啡肽的酒精组腹侧被盖区神经元THser40(TH的磷酸化形式)的免疫组织化学染色(c)。另一组为对照饮食大鼠(a)(CON对照组，n=7)和酒精饮食大鼠(b)(CON-乙醇组，n=7)，用人工脑脊液灌注代替β-内啡肽灌注。与对照组大鼠相比，大鼠(β-内啡肽-酒精组，n=6)接受NAc内注入β-内啡肽的大鼠腹侧被盖区中THser40阳性细胞的数量显著增加[*P0.05，β-内啡肽-酒精对Con-内啡肽-酒精；(E)]。比例尺，50um(x)
讨论
我们目前的数据显示，针灸在HT7，而不是在LI5，明显减少了酒精戒断震颤。这与先前的报道一致，即针灸可以减轻酒精戒断动物和酗酒者的AUD相关戒断综合征。由于针刺穴位可能导致运动障碍并对震颤产生普遍影响，本研究试图通过比较HT7针刺和LI5针刺来控制这种可能性。HT7针刺降低了酒精依赖大鼠的震颤活动，而对照组饮食喂养的大鼠的震颤活动没有影响。焦虑样行为、自我给药和NAc中细胞外β-内啡肽水平的降低也显示出类似的趋势。这表明HT7针刺与酒精戒断反应之间存在相互作用。在本研究中，系统给药纳洛酮，一种非选择性阿片受体拮抗剂，阻断HT7抑制酒精戒断震颤。此外，HT7针刺可防止酒精依赖大鼠NAc中细胞外β-内啡肽水平的降低。这些结果表明，HT7刺激可以产生伏隔核β-内啡肽介导的抑制酒精戒断震颤。我们的结果显示，刺激HT7可抑制酒精戒断大鼠下丘脑ARC神经元放电频率的降低。类似地，ARC中c-Fos表达的显著增加证明HT7针刺引起投射到NAc的ARC中的神经元激活。这些结果提供了强有力的证据，表明针灸增强了阿片介导的ARC向NAc投射。由于含β-内啡肽的纤维大量存在于中枢，支配NAc，并介导针刺抑制吗啡戒断症状，我们推测，从中枢投射到NAc的β-内啡肽能神经元可能有助于针刺降低酒精依赖的能力。
目前的研究表明，针刺增加了酒精依赖大鼠高架十字迷宫开放臂时间，提示针灸具有抗焦虑的功能。此外，针灸减少了酒精戒断过程中的自我给药。结果表明，针刺和β-内啡肽均不会改变高架十字迷宫中水的自我给药和运动活动，这意味着针刺和β-内啡肽抑制酒精增强的反应和焦虑样行为可能不是由于一般完成行为和运动障碍的减少。再加上先前观察到的焦虑样状态导致酒精依赖大鼠饮酒复发，目前的结果表明，针刺引起的饮酒行为减少可能是焦虑样状态减弱的结果。此外，尽管身体戒断综合征和饮酒行为之间的确切关系仍有待阐明，但酒精戒断震颤已被认为是一种强大的应激源，这支持了震颤可能作为酒精复发的驱动因素发挥重要作用的观点。总之，结果表明，针灸可能通过减少震颤和焦虑样状态来减轻酒精依赖大鼠复用。此外，在yohimbine治疗的大鼠中，局部NAc注射β-内啡肽可减少焦虑样行为，针刺可分别降低血浆皮质酮水平。yohimbine已被建议通过去甲肾上腺素能控制下丘脑垂体肾上腺系统来增加压力。因此，这意味着针灸减弱应激反应可能是通过抑制下丘脑-垂体-肾上腺系统对NAc中β-内啡肽的反应来介导的。一些研究表明，NAc中的β-内啡肽可能通过DA非依赖性机制在介导应激适应性反应中发挥重要作用。例如，已有研究表明，细胞外β-内啡肽在NAc中的水平随着海洛因强化行为消失的压力成分和厌恶刺激的增加而增加。在另一项研究中也得到了类似的结果，其中压力促进了对β-内啡肽降低的小鼠对新奇摄食的厌恶。
确切的神经化学机制β-内啡肽的介导作用尚不清楚，但一些证据表明，β-内啡肽通过抑制促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的分泌来减弱应激反应。因此可以认为，NAc中的β-内啡肽可能通过抑制应激反应来减少对酒精的复用。同样，慢性酒精暴露后脑中β-内啡肽能活性的降低被认为是酒精依赖者的烦躁症状和焦虑状态的原因，这可能有助于负强化。此外，酒精戒断过程中下丘脑β-内啡肽能神经元活动的减少可能介导躯体戒断综合征和焦虑样行为。总之，这些发现支持了这样的假设，即弓状核的β-内啡肽神经元可能介导了针刺抑制酒精戒断症状和酗酒复发的能力。
我们先前的研究表明，HT7针刺防止了NAc中DA的减少和酒精戒断过程中的戒断体征。这项研究提出了针灸可能通过使NAc中DA释放正常化而在减少酒精依赖方面发挥功能作用的可能性。慢性酒精给药的戒断导致中脑边缘通路中DA传递的减少，提示在酒精戒断期间的负性情感状态和躯体戒断症状的神经化学机制，成瘾者经历的强烈的酒精渴求，以及酒精依赖大鼠的酒精寻求行为。由于消极的情感状态可以刺激酒精依赖大鼠继续寻找酒精的行为，针刺或向NAc内注入β-内啡肽所产生的减少的酒精自我给药可能是通过抑制NAc中DA的耗尽来实现的，焦虑样行为的平行减少揭示了这一点。我们的结果表明，NAc内注入β-内啡肽恢复了酒精戒断时中脑腹侧被盖区中缺失的TH表达，并增加了中脑腹侧被盖区中的TH磷酸化。这表明，在酒精戒断过程中，向NAc内注入β-内啡肽诱导了下多巴胺能状态的逆转。诱导细胞突触激活的条件似乎促进了外周交感神经元和中枢儿茶酚胺能神经元中TH的表达和磷酸化。由于伏隔核GABA向中脑腹侧被盖区DA神经元的输入受到阿片受体的调节，我们推测β-内啡肽可能增强中脑边缘通路中DA的传递。因此，中脑腹侧被盖区TH表达的增加和对β-内啡肽反应的磷酸化可能是由于中脑腹侧被盖区DA神经元活性增强所致。目前的结果表明，在NAc中局部注射β-内啡肽模仿针刺对酒精戒断症状的影响，因此，HT7针刺可能通过激活中脑腹侧被盖区中的DA神经元来减少酒精依赖大鼠的负性情感状态和饮酒行为，这是由激活内啡肽传入NAc而引起的，因此，HT7针刺可能通过激活中脑腹侧被盖区中的DA神经元来减少乙醇依赖大鼠的负性情感状态和饮酒行为。
目前的结果显示，在慢性酒精戒断过程中，震颤、焦虑样行为和酒精自我给药显著增加。此外，在酒精依赖大鼠的NAc中观察到明显的β-内啡肽减少。先前的研究表明，酒精依赖动物的下丘脑β-内啡肽能活性降低。这些发现增加了一种可能性，即NAC中β-内啡肽释放减少可能是由于在慢性酒精戒断过程中抑制了内啡肽向NAc的输入。同样，与水中毒状态相比，酒精中毒状态下的NAcβ-内啡肽水平显著降低。由于下丘脑内啡肽能神经元支配NAc，在酒精戒断过程中降低的β-内啡肽能神经元活性将导致NAc中的GABA神经元的兴奋。为了支持这一假设，先前使用全细胞记录和体内微透析的研究表明，NAcGABA神经元在反复暴露于可卡因的戒断过程中变得过度兴奋。尽管β-内啡肽如何调节NAc中的DA水平仍不清楚，但已有研究表明，吗啡抑制NAc中的GABA神经元，从而使中脑腹侧被盖区中的DA神经元不受抑制。此外，NAcGABA神经元在中脑腹侧被盖区中突触为DA神经元。因此，我们可以推测，β-内啡肽通过阿片受体对投射到中脑腹侧被盖区DA神经元的NAc内GABA神经元产生抑制作用。因此，可以预期，在酒精戒断过程中，内源性阿片肽NacGABA-内啡肽的水平低于正常状态时，可能会使NAc中的GABA神经元失去抑制，从而导致中脑腹侧被盖区中DA神经元的活性降低。酒精依赖大鼠显示出NAc中DA释放明显不足和中脑腹侧被盖区中DA神经元的放电率降低，并且在酒精戒断过程中NAC中下多巴胺能状态的逆转减弱了情感和躯体戒断症状。在内源性阿片系统与DA能神经传递相互作用的基础上，慢性酒精暴露对β-内啡肽神经元的抑制可能导致中脑边缘DA系统DA能活性降低。因此，目前的结果表明，伏隔核β-内啡肽能活性的显著降低可能至少部分地代表了酒精戒断的烦躁和神经症状的潜在机制。有人提出，酒精戒断过程中的烦躁和抑郁状态可能是下丘脑中β-内啡肽能活性降低的结果。
虽然我们的和其他动物研究都揭示了针灸抑制酒精相关行为的一致结果，例如酒精渴求或酒精消耗，但人体研究显示针灸在减少与酒精成瘾相关的临床症状方面的效果参差不齐。例如，对照研究表明，与在非特定穴位进行针灸治疗的对照组相比，在治疗药物滥用的特定穴位上进行针灸治疗表现出对酒精的需求较少，饮酒次数也较少。然而，Worner等人报告了针灸治疗酒精相关症状的阴性结果。这种差异可能是由于许多变数，包括穴位位置，治疗时间，以及刺激频率和强度，导致人体研究中针灸师之间的低重复性和高个体差异。为了支持这一点，我们先前的研究表明，在针灸师之间观察到针灸刺激强度和频率的相当大的差异。
总之，我们发现针灸通过恢复身体上依赖酒精的大鼠NAc中降低的β-内啡肽水平来抑制震颤，焦虑样行为和饮酒行为。然而，确定针刺诱导的感觉刺激和下丘脑β-内啡肽神经元之间的神经元联系的具体机制还需要进一步的研究。最后，针灸可能是通过直接激活脑通路来治疗AUD。
ChangS,KimDH,JangEY,etal.Acupunctureattenuatesalcoholdependencethroughactivationofendorphinergicinputtothenucleusaccumbensfromthearcuatenucleus.SciAdv..5(9):eaax.
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